Новости

May 14, 2023

Структурная ремоделация углерода

Том «Природные коммуникации»

Nature Communications, том 14, номер статьи: 1001 (2023) Цитировать эту статью

2243 Доступа

32 Альтметрика

Подробности о метриках

У Escherichia coli 14-цистронный оперон Phn, кодирующий углерод-фосфорную лиазу, позволяет утилизировать фосфор из широкого спектра стабильных фосфонатных соединений, содержащих CP-связь. Было показано, что субъединица PhnJ в рамках сложного многоэтапного пути расщепляет CP-связь по радикальному механизму, однако детали реакции не удалось сразу согласовать с кристаллической структурой ядра CP-лиазы PhnGHIJ массой 220 кДа. комплекс, оставляющий значительный пробел в нашем понимании распада фосфонатов бактериями. Здесь мы показываем с помощью одночастичной криогенной электронной микроскопии, что PhnJ опосредует связывание двойного димера АТФ-связывающих кассетных белков, PhnK и PhnL, с основным комплексом. Гидролиз АТФ вызывает радикальное структурное ремоделирование, приводящее к открытию основного комплекса и реконфигурации металлсвязывающего и предполагаемого активного центра, расположенного на границе раздела между субъединицами PhnI и PhnJ.

Бактерии развили сложные механизмы извлечения основных макроэлементов, таких как фосфор, сера, азот и углерод, из окружающей среды. У грамотрицательных Escherichia coli ограничение фосфатов индуцирует регулон Pho и экспрессию 14-цистронного оперона Phn (phnCDEFGHIJKLMNOP), что обеспечивает поглощение и расщепление фосфонатов в качестве альтернативного источника фосфора1,2,3. Фосфонаты структурно подобны эфирам фосфорной кислоты и другим первичным метаболитам, но содержат высокостабильную связь углерод-фосфор (C-P), устойчивую к гидролитическому расщеплению4. Таким образом, фосфонаты могут действовать как ингибиторы и аналоги переходного состояния и очень полезны в промышленности в качестве детергентов, гербицидов (например, глифосат/RoundUp®) и антибиотиков5. Оперон Phn кодирует импортер АТФ-связывающей кассеты (ABC) (PhnCE) и периплазматический связывающий белок (PhnD) для поглощения фосфоната6, регулятор транскрипции (PhnF)7, в дополнение к полному ферментативному аппарату (PhnGHIJKLMNOP), необходимому для деградации и включения. в общий метаболизм через 5-фосфо-α-D-рибозил-1-дифосфат (PRPP)8,9,10,11. Путь C-P-лиазы имеет чрезвычайно широкий спектр субстратов и способен перерабатывать как алифатические, так и объемистые ароматические фосфонаты10,12,13. По этой причине, а также в связи с многочисленными применениями фосфонатов, существует сильный фундаментальный интерес к пониманию механизма разрушения фосфонатов C-P-лиазой. Детальные функциональные и механистические исследования отдельных ферментативных субъединиц, кодируемых опероном Phn, привели к предложенному механизму реакции, в котором фосфонатный фрагмент первоначально связывается либо с АТФ, либо с ГТФ посредством замещения азотистого основания в реакции, катализируемой PhnI и в присутствии PhnG, PhnH и PhnL8. Было показано, что PhnM высвобождает пирофосфат из образовавшегося 5'-фосфорибозил-α-1-фосфоната, что позволяет PhnJ расщеплять связь C-P посредством строго анаэробного S-аденозилметионинового (SAM)-зависимого механизма реакции глицин-радикала. Наконец, совместное действие PhnP и PhnN превращает полученную циклическую рибозу в PRPP (дополнительный рисунок 1)9,10.

Однако из-за сложности реакции, большого количества участвующих белковых субъединиц и комплексов, а также анаэробных требований до сих пор не удалось получить полное механистическое понимание пути C-P-лиазы. Кристаллическая структура основного ферментного комплекса Phn(GHIJ)2 выявила симметричный гетерооктамер, состоящий из компактного центрального тетрамера субъединиц PhnI и PhnG, каждый из которых индивидуально взаимодействует с более дистальными субъединицами PhnJ и PhnH14. Интригующей особенностью этой структуры является то, что участок кластера Fe4S4, предположительно необходимый для образования радикалов и активации ферментов, расположен на значительном расстоянии (30 Å) от остатка глицина в PhnJ, который, как показали исследования дейтериевого обмена, стабильное расположение радикала между циклами ферментативного оборота15. Кристаллическая структура также выявила еще один предполагаемый активный центр на границе раздела PhnI и PhnJ, содержащий ион Zn2+, координированный двумя консервативными остатками His в PhnI, оба из которых, как было показано, необходимы для роста на фосфонате. Наконец, было обнаружено, что из двух нетранспортёрных модулей ABC, кодируемых опероном Phn, PhnK и PhnL, одна субъединица PhnK может связываться с PhnJ через консервативную спиральную область, известную как центральный домен вставки (CID)14. У бактерий модули ABC в основном связаны с импортерами метаболитов, где они взаимодействуют как димеры с трансмембранным доменом, связывая и гидролизуя АТФ, тем самым генерируя энергию и движение, необходимые для транспорта против градиента концентрации16. Таким образом, общая димерная структура модулей ABC мало что дает для понимания функции единственной субъединицы PhnK, связанной с коровым комплексом C-P лиазы. Более того, это несоответствие предполагает, что наблюдаемая структура может не отражать истинное функциональное состояние фермента и не дает обоснования для присутствия другого, важного модуля ABC, PhnL. В этой работе мы показываем генетически и ферментативно, что АТФазная активность как PhnK, так и PhnL необходима для роста E. coli на фосфонатах, и используем криогенную электронную микроскопию (крио-ЭМ), чтобы выявить двойной димер двух субъединиц на C-P. лиазный основной комплекс. Структурный анализ в условиях обмена АТФ дополнительно показывает, что гидролиз приводит к открытию основного комплекса, обнажая и перестраивая активный сайт Zn2+, расположенный между субъединицами PhnI и PhnJ.